RT-QPCR EasyTM Taqman uma mistura mestra do tempo real RT-PCR da etapa

RT-qPCR EasyTM (uma etapa) - Taqman

Para o PCR do tempo real usando o cDNA, refinou o ADN

Introdução de produto

Os produtos fáceis de uma etapa da série de Foregene RT-PCR realizam que a reação integrada do RNA ao ADN dobro-encalhado, isto é, para inverter a transcrição e a amplificação do PCR estão terminadas no mesmo tubo de centrifugador da reação e no mesmo sistema de reação, assim as etapas experimentais simplificadas, o plano experimental aperfeiçoaram, e a eficiência experimental melhorou.

RT-qPCR EasyTM (uma etapa) - Taqman usando a polimerase de ADN de Foregene HotStar Taq, o sistema aperfeiçoado do qPCR de Taqman pode rapidamente e especificamente executar a detecção quantitativa do RT-qPCR do tempo real de moldes do RNA do traço.

Condições do transporte e de armazenamento

• Condições do transporte: O processo inteiro é transportado em uma caixa de gelo de baixa temperatura para assegurar-se de que o jogo esteja em um estado de <4>
• Condições de armazenamento: O jogo é armazenado em -20℃. Armazene o produto em um refrigerador da temperatura constante em -20℃ imediatamente depois do recibo. Se as condições de armazenamento são apropriadas, o produto não degradará nenhum desempenho durante o período de uma validez de 1 ano.

Informação componente do jogo

• Mistura-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM: Reverso Transcriptase de Foregene, inibidor do RNase, polimerase de ADN de Foregene HotStar Taq, relação aperfeiçoada dos dNTPs, Mg2+, estabilizador, realçador, e optimizer.
• Tintura da referência de ROX: Usado geralmente em cyclers térmicos do PCR do tempo real das empresas tais como ABI, Stratagene, etc., para ajustar a diferença entre os tubos do PCR causados por erros de carga da amostra do PCR. A concentração de tintura da referência de ROX exigida por instrumentos diferentes é diferente, e o usuário pode adicioná-la de acordo com a concentração recomendada do instrumento.

Precauções:

os reagentes de u devem evitar a congelação repetida e thawing, se não o desempenho dos reagentes diminuirá ou tornar-se-á inválido.

u os reagentes no jogo deve ser protegido da luz e ser armazenado em -20°C.

u recomenda-se usar a extração da amostra ou o RNA fresco do molde armazenada em -80°C (o RNA deve evitar a congelação repetida e thawing).

u a fim evitar a contaminação do RNase, executa por favor a experiência no espaço RNase-livre; as pontas da pipeta e os tubos do PCR usados devem ser RNase-livres; e vista luvas descartáveis e máscaras.

u este jogo deve ser usado com primeiras demão específicas para experiências. Selecione por favor as primeiras demão específicas para que o gene seja amplificado de acordo com as necessidades da experiência.

u antes de usar, pôs a mistura-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM sobre o gelo completamente ao derretimento, ao súbito e à mistura bem antes de usar; a preparação do sistema deve ser operada em um banho de gelo para melhorar o desempenho do jogo e para aumentar a amplificação do PCR.

Concentração do RNA do molde

RT-qPCR EasyTM (uma etapa) - Taqman: (1 RNA do total do ng pg-100 sistema)/20 μl.

Guia da operação

: Preparação dos materiais e dos reagentes

• Prepare o molde preparado do RNA (se recomenda usar jogos da série do jogo do isolamento do RNA do total de Foregene para extrair e refinar o RNA), primeiras demão específicas (μM 10) e materiais de consumo e instrumentos relativos.

Nota: Assegure por favor a integridade do RNA e tente-a usar o RNA extraído das amostras frescas.

• Mistura-Taqman posta de 2× RT-qPCR EasyTM, tintura RNase-livre da referência de ddH2O, e de 20× ROX (caso necessário) no gelo para deixá-la derreter naturalmente, e passar rapidamente a parede do tubo para misturar até o uso.

B: Preparação do sistema RT-qPCR

A mistura-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM é conveniente e rápida de usar-se, e evita a poluição durante a operação e os erros experimentais causados por preparações múltiplas do sistema de reação na maior medida do possível. Ao usar-se, somente a metade do volume do sistema de reação (por exemplo, se o sistema de reação é o μl 20, tome 10 a solução da mistura-Taqman do μl 2× RT-qPCR EasyTM), adiciona uma quantidade apropriada de molde do RNA e de primeiras demão específicas, e adiciona ddH2O RNase-livre para compor o volume. A preparação específica do sistema de reação RT-qPCR pode consultar para apresentar abaixo 1.

Tabela 1: Preparação do sistema RT-qPCR

Nota: A primeira demão dianteira e a primeira demão reversa são primeiras demão específicas para o gene do alvo. O sistema do qPCR pode ser ajustado de acordo com necessidades experimentais e modelo do PCR. Para a concentração final da maioria de primeiras demão, nós recomendamos 400nM. Ajuste por favor a dosagem da primeira demão e da ponta de prova específicas de acordo com a concentração preparada de acordo com nossa concentração final recomendada. Para o qPCR com sistema 50μl, refira por favor o sistema 20μl para ajustar proporcionalmente a quantidade de reagentes.

1*: Escolha a concentração final apropriada de tintura da referência de ROX de acordo com instrumentos quantitativos diferentes do PCR. A concentração ótima de tintura da referência de ROX para máquinas quantitativas comuns do PCR é mostrada na seguinte tabela:

C: Ajuste do sistema de reação RT-qPCR

• Após ter preparado o sistema RT-qPCR com referência à tabela acima, mistura delicadamente (você pode usar uma ponta da pipeta delicadamente à pipeta; você pode igualmente misturar em um vortexer e em um centrifugador momentaneamente para recolher o líquido dispersado na parede do tubo ou no tampão do tubo, e em um lugar na caixa de gelo para uso posterior).
• Refira os ajustes do programa da reação RT-qPCR (tabela 2) para ajustar a temperatura e o tempo da reação.

Nota: A fim assegurar a atividade da mistura-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM e melhorar sua eficiência da amplificação, é o melhor preparar o sistema de reação RT-qPCR após ter estabelecido o programa do instrumento do PCR, de modo que o programa da reação possa ser incorporado imediatamente depois que a preparação do sistema é terminada.

• A fim obter o melhor efeito do qPCR, o PCR do inclinação pode ser usado para aperfeiçoar as condições da reação para moldes diferentes e primeiras demão diferentes.

Nota: A variação da temperatura da extensão da polimerase de ADN de Foregene Hotstar Taq forneceu neste jogo é: 60-72℃, e a melhor temperatura da extensão são 72℃.

O seguinte é um exemplo de condições da reação RT-qPCR. Recomenda-se usar um método do pas-de-deux para a reação do PCR. Quando a concentração do molde é demasiado baixa causar a amplificação não específica, o baixo valor do TM da primeira demão conduz à baixa eficiência da amplificação ou repetibilidade pobre da curva da amplificação, etc., recomenda-se tentar o método da três-etapa para a reação do PCR. Consulte para apresentar 2-1 (método do pas-de-deux) e tabela 2-2 (método da três-etapa) para o ajuste de condições da reação RT-qPCR.

Tabela 2-1: Ajuste do programa da reação RT-qPCR (método do pas-de-deux)

Tabela 2-2: Ajuste do programa da reação RT-qPCR (método da três-etapa)

1*: O tempo reverso da transcrição pode ser ajustado de acordo com necessidades experimentais. Os genes endógenos gerais tais como o β-actínio precisam somente 10 minutos; para detectar genes expressados específicos, o tempo reverso da transcrição pode ser apropriadamente prolongado como necessário.

2*: Ajuste uma estadia específica de acordo com o comprimento do fragmento amplificado do alvo. A velocidade da amplificação da polimerase de ADN de Foregene HotStar Taq é 2kb/min

Nota: As condições da reação do PCR variam segundo as condições estruturais do molde, das primeiras demão, etc. Para moldes do RNA com estruturas secundárias complexas, recomenda-se usar 42℃ para a primeira etapa da transcrição reversa. Na operação específica, é necessário projetar as condições ótimas da reação de acordo com as condições específicas tais como o tamanho do fragmento do alvo, a sequência baixa do fragmento amplificado e o índice do GC e o comprimento da primeira demão, incluindo a temperatura, o tempo da extensão, etc. de recozimento.

Fluxo de trabalho: