Preparação e precauções da extração do RNA

Esterilização de pontas da pipeta e tubos do EP, etc.

1. Prepare 0,1% (um milésimo) DEPC (substância altamente tóxica) com água deionized, use-o com cuidado em uma capa das emanações, e armazene-o em 4°C longe da luz;

A água de DEPC é água pura tratada com o DEPC e esterilizada pela alta temperatura e pela alta pressão. Testado para estar livre do RNase, do DNase e da protease.

2. Põe a ponta da pipeta e o tubo do EP em 0,1% DEPC, e assegure-se de que a ponta da pipeta e o tubo do EP estejam enchidos com os 0,1% DEP.

3. Proteja de claro, deixe o suporte, durante a noite (12-24h)

4. A caixa que contém a ponta e o tubo do EP não precisa de ser embebida em DEPC. Após aproximadamente ter removido a água de DEPC na ponta ou no tubo do EP, embale-o acima e envolva-o acima.

5. 121 graus Célsio, 30min

6. 180 graus Célsio, secam por diversas horas (pelo menos 3 horas)

Nota: a. luvas e máscaras do látex do desgaste ao segurar DEPC! b, ou sem esterilização de DEPC, 130 ℃, autoclave 90min (esterilização de alta temperatura de muitos laboratórios duas vezes)

Considerações da extração do RNA

Dois fenômenos principais da falha do isolamento do RNA do tecido

A degradação do RNA e os resíduos das impurezas nos tecidos, em relação à degradação, deixaram-nos primeiramente olhar porque o RNA extraiu das pilhas cultivadas não é degradado facilmente. Os reagentes existentes todos da extração do RNA contêm os componentes que inibem rapidamente o RNase. Adicione o lysate às pilhas cultivadas, e misture-o simplesmente, todas as pilhas podem completamente ser misturadas com o lysate, e as pilhas lysed completamente. Depois que as pilhas lysed, os ingredientes ativos no lysate inibem imediatamente o RNase intracelular, assim que o RNA permanece intacto. Aquele é dizer, porque as pilhas cultivadas são contactadas facilmente e inteiramente com o lysate, seu RNA não é degradado facilmente; por outro lado, o RNA no tecido é degradado facilmente porque as pilhas no tecido não são fáceis contactar rapidamente o lysate. devido ao suficiente contato. Assim, supor lá é uma maneira de transformar o tecido em uma única pilha quando a atividade de inibição do RNA, o problema da degradação poderia completamente ser resolvida.

A trituração do nitrogênio líquido é a mais eficaz tal método. Contudo, o método de trituração do nitrogênio líquido é muito incômodo, especialmente quando o número de amostras é grande. Isto causou a melhor coisa seguinte: o homogenizador. O método do homogenizador não considera a pergunta de como a atividade do RNase é inibida antes que as pilhas estejam contactadas com o lysate, mas reza um pouco que a taxa de rompimento do tecido é mais rápida do que a taxa em que o RNase intracelular degrada o RN.

O efeito do homogenizador elétrico é melhor, e o efeito do homogenizador de vidro é pobre, mas geralmente, o método do homogenizador não pode impedir o fenômeno da degradação. Consequentemente, se a extração é degradada, o homogenizador elétrico original deve ser usado moendo com nitrogênio líquido; o homogenizador de vidro original deve ser mudado a um homogenizador elétrico ou diretamente ser moído com nitrogênio líquido. O problema é quase 100% praticável. obtenha resolvido.

O problema do resíduo da impureza que afeta experiências subsequentes tem umas causas mais diversas do que a degradação, e as soluções são correspondentemente diferentes. Em conclusão, se há uma degradação ou umas impurezas residuais no tecido, o método/reagente da extração para o material experimental específico deve ser aperfeiçoado. Você não tem que usar suas amostras preciosas para a otimização: você pode comprar alguns animais pequenos como peixes/galinha do mercado, para tomar a parte correspondente do material para a extração do RNA, e a outra peça para a extração da proteína - moagem com boca, estômago e extrato dos intestinos.

O RNA do alvo do RNA extraído é usado para diferente continua experiências, e suas exigências de qualidade são diferentes

a construção da biblioteca do cDNA exige a integridade do RNA sem resíduos de inibidores da reação de enzima; Do norte exige uma integridade mais alta do RNA e abaixam exigências para resíduos dos inibidores da reação de enzima; RT-PCR não exige a integridade demasiado alta do RNA, mas inibe reações de enzima. As exigências do resíduo são restritas. A entrada determina a saída; cada vez que o objetivo é obter o RNA da pureza a mais alta, custará os povos e o dinheiro.

Coleção/armazenamento das amostras

Os fatores que afetam a degradação depois que a amostra sae o body/or vivo do ambiente original do crescimento, as enzimas endógenas na amostra começarão a degradar o RNA, e a taxa da degradação é relacionada ao índice de enzimas endógenas e de temperatura. Tradicionalmente, há somente duas maneiras de inibir completamente a atividade de enzima endógena: adicione o lysate imediatamente e homogeneize-o completamente e rapidamente; corte em partes pequenas e para congelar-se imediatamente no nitrogênio líquido. Ambas as aproximações exigem a operação rápida. O último é apropriado para todas as amostras, quando o anterior for somente apropriado para tecidos com baixo índice das pilhas e de enzimas endógenas e mais fácil de homogeneizar. Especificamente, tecido de planta, fígado, thymus, pâncreas, baço, cérebro, gordura, tecido do músculo, etc. são congelados melhor com nitrogênio líquido antes da continuação.

Fragmentação e homogeneização das amostras

Os fatores que afetam a fragmentação da amostra da degradação e do rendimento são para a homogeneização completa, que é para a liberação completa e completa do RNA. As pilhas podem diretamente ser homogeneizadas sem quebrar-se. Os tecidos podem ser homogeneizados somente depois a quebra. O fermento e as bactérias precisam de quebrar-se com enzimas correspondentes antes que possa ser homogeneizado. Os tecidos com mais baixo índice endógeno da enzima e homogeneização mais fácil podem ser esmagados e homogeneizado ao mesmo tempo no lysate por um homogenizador; tecido de planta, fígado, thymus, pâncreas, baço, cérebro, gordura, tecido do músculo e outras amostras, são tampouco altos em enzimas endógenas ou não são homogeneizados facilmente, assim que o rompimento e a homogeneização do tecido devem ser executados separadamente. O método o mais seguro e o mais produtivo da fragmentação está moendo com nitrogênio líquido, e o método o mais seguro da homogeneização é o uso de um homogenizador elétrico. Uma nota especial sobre a trituração com nitrogênio líquido: a amostra não deve ser thawed durante o processo de trituração inteiro, porque as enzimas endógenas são mais prováveis funcionar quando congeladas.

Escolha do lysate

Afetando a conveniência da operação e os fatores de impurezas endógenas residuais as soluções de uso geral do lysis podem quase inibir a atividade do RNase. Consequentemente, o ponto-chave de escolher uma solução do lysis é considerar em combinação com o método da purificação. Há uma exceção: as amostras com índice endógeno alto da enzima são recomendadas usar um lysate que contém o fenol para aumentar a capacidade para neutralizar enzimas endógenas.

Escolha do método da purificação

Os fatores que afetam impurezas endógenas residuais, velocidade da extração para amostras limpas tais como pilhas, resultados satisfatórios podem ser obtidos com quase todo o método da purificação à mão. Mas para muitas outras amostras, especialmente aquelas com níveis elevados de impurezas tais como as plantas, fígado, bactérias, etc., escolher um método apropriado da purificação é crucial. O método centrífugo da purificação da coluna tem uma velocidade rápida da extração e pode eficazmente remover as impurezas que afetam a reação enzimático subsequente do RNA, mas é cara (Foregene pode oferecer jogos eficazes na redução de custos, mais detalhes clica aqui); usar métodos econômicos e clássicos da purificação, tais como a precipitação do LiCl, pode igualmente obter resultados satisfatórios, mas o tempo da operação é longo.

“Três disciplinas e oito atenções” para a extração do RNA

Disciplina 1: Põe uma extremidade à contaminação de enzimas exógenas.

Nota 1: Vista restritamente máscaras e luvas.

Nota 2: Os tubos de centrifugador, as cabeças da ponta, as hastes da pipeta, os tanques da eletroforese, e os bancos experimentais envolvidos na experiência devem completamente ser dispostos.

Nota 3: Os reagentes/soluções envolvidas na experiência, especialmente água, devem ser RNase-livres.

Disciplina 2: Obstrua a atividade de enzimas endógenas

Nota 4: Escolha um método apropriado da homogeneização.

Nota 5: Escolha um lysate apropriado.

Nota 6: Controle a quantidade começando da amostra.

Disciplina 3: Esclareça sua finalidade da extração

Nota 7: Com todo o sistema do lysate que aproxima a quantidade começando máxima de amostra, a taxa de êxito da extração deixa cair agudamente.

Nota 8: O único critério econômico para a extração bem sucedida do RNA é um sucesso em experiências subsequentes, não rendimento.

10 fontes superiores de contaminação do RNase

1. Os dedos são a primeira fonte de enzimas exógenas, assim que as luvas devem ser vestidas e substituído frequentemente. Além, as máscaras devem igualmente ser vestidas, porque respirar é igualmente uma fonte importante de enzimas. Um benefício adicional de vestir uma máscara da luva é proteger o experimentador.

2. As pontas da pipeta, tubos de centrifugador, introduzem com pipeta – o RNase não pode ser neutralizado pela esterilização apenas, assim que as pontas da pipeta e os tubos de centrifugador devem ser tratados com o DEPC, mesmo se são marcadas como DEPC tratou. É o melhor usar uma pipeta do objetivo especial, limpa-a com uma bola de algodão do álcool de 75% antes de usar, especialmente a haste; além, para ser certo não usar um removedor principal.

3. A água/amortecedor deve estar livres da contaminação do RNase.

4. Pelo menos a tabela do teste deve ser limpada limpa com as bolas de algodão do álcool de 75%.

• O RNase que endógeno todos os tecidos contêm enzimas endógenas, congelação tão rápida dos tecidos com nitrogênio líquido é a melhor maneira de reduzir a degradação. O armazenamento do nitrogênio líquido/método de moedura é certamente incômodos, mas é a única maneira para tecidos com níveis elevados de enzimas endógenas.

6. O RNA prova produtos da extração do RNA pode conter traços de contaminação do RNase.

7. A extração do plasmídeo da extração do plasmídeo usa frequentemente o Rnase para degradar o RNA, e o Rnase residual deve ser digerido com protease K e ser extraído pelo PCI.

8. O armazenamento mesmo se é armazenado na baixa temperatura, quantidades do RNA de traço de RNase causará a degradação do RNA. A melhor solução para a preservação a longo prazo do RNA é uma suspensão de sal/álcool, porque o álcool inibe toda a atividade enzimático em baixas temperaturas.

9. Quando os cations (Ca, magnésio) contêm estes íons, aquecer-se em 80C por 5 minutos fará com que o RNA esteja fendido, assim que se o RNA precisa de ser aquecido, a solução da preservação precisa de conter um agente chelating (citrato de sódio de 1mM, pH 6,4).

10. As enzimas usadas em experiências subsequentes podem ser contaminadas pelo RNase.

10 pontas para a extração do RNA

1: Rapidamente para impedir a atividade do RNase. As amostras são congeladas rapidamente após a coleção, e o RNase é neutralizado pela operação rápida durante o lysis.

2: Escolha um método apropriado da extração para o tecido com índice alto do ribozyme, e o tecido adiposo é o melhor usar o método que contém o fenol.

3: A qualidade da previsão exige do norte, a construção da biblioteca do cDNA exige a integridade alta, e RT-PCR e o RPA (ensaio da proteção do Ribonuclease) não exigem a integridade alta. RT-PCR exige a pureza alta (resíduos do inibidor de enzima).

4: A homogeneização completa é a chave a melhorar o rendimento e a reduzir a degradação.

5: Verifique a integridade da detecção da eletroforese do RNA, 28S: 18S = 2: 1 é um sinal completo, 1: 1 é igualmente aceitável para a maioria de experiências.

6: Remoção do ADN para RT-PCR, análise da disposição é o melhor usar o Dnase I para remover o ADN.

7: Reduza a contaminação de enzimas exógenas - as enzimas não podem ser importadas da parte externa.

8: Ao concentrar o ácido nucleico da baixo-concentração, um reagente da co-precipitação deve ser adicionado. Mas para impedir o co-precipitant que contém enzimas e contaminação do ADN.

9: Dissolva completamente o RNA caso necessário, calor em 65C por 5 minutos.

método apropriado do armazenamento

Pode ser armazenado – 20C por um curto período de tempo, e em – em 80C por muito tempo. A primeira etapa em melhorar rendimentos do RNA é realizar que o índice do RNA de amostras diferentes varia extremamente. Abundância alta (2-4ug/mg) como o fígado, pâncreas, coração, abundância média (0.05-2ug/mg) como o cérebro, embrião, rim, pulmão, thymus, ovário, baixa abundância (<0>

1: Lyse pilhas para liberar o RN – se o RNA não é liberado, o rendimento estará reduzido. Os trabalhos elétricos da homogeneização melhores do que outros métodos da homogeneização, mas podem igualmente precisar de ser combinado com outros métodos, tais como o nitrogênio líquido que tritura, digestão enzimático (Lysozyme/Lyticase)

2: Otimização do método da extração. Os problemas os mais grandes com métodos fenol-baseados são estratificação incompleta e perda parcial do RNA (o supernatant não pode completamente ser removido). A estratificação incompleta é devido ao índice alto de ácido nucleico e de proteína, que pode ser resolvido aumentando a quantidade de lysate usada ou reduzindo a quantidade de amostra. Uma etapa da extração de clorofórmio foi adicionada ao tecido adiposo. A perda do RNA pode ser reduzida para trás-bombeando ou removendo a camada orgânica seguida pela centrifugação. O problema o mais grande com coluna centrifugação-baseou métodos é amostra adicional.

Pontas clássicas da extração

1. Purificação do fenol: Adicione um volume igual de fenol/clorofórmio e de mistura do 1:1 vigorosamente por 1-2 minutos. Centrifugador na alta velocidade por 2 minutos. Remova com cuidado o supernatant (80-90%). Nunca obtenha à camada média. Um volume igual da solução da reação pode ser adicionado ao fenol/clorofórmio e o supernatant removeu. Os dois supernatants podem ser misturados junto para que a precipitação ácida nucleica melhore o rendimento. Não seja demasiado delicado ao misturar, e não tente remover todo o supernatant.

2. Lavagem com álcool etílico 70-80%: Durante a lavagem, o ácido nucleico deve ser suspendido para assegurar-se de que o sal residual esteja lavado afastado. Ao mesmo tempo, imediatamente depois do derramamento fora do álcool etílico, o centrifugador na alta velocidade por alguns segundos, e remove então o álcool etílico residual com uma pipeta. Dissolva após estar na temperatura ambiente por 5-10 minutos.

11. Extração de organizações especiais

1. Tecido fibroso: A chave à extração do RNA do tecido fibroso tal como o coração/músculo esqueletal é interromper completamente o tecido. Estes tecidos têm a baixa densidade de pilha, assim que a quantidade de RNA pelo peso de unidade do tecido é baixa, e é o melhor usar-se como muita quantidade começando como possível. Seja certo moer completamente o tecido sob circunstâncias de congelação.

2. Tecidos com alto - índice da proteína/gordura: o cérebro/índice gordo vegetal é altos. Após a extração do PCI, o supernatant contém os flóculo brancos. O supernatant deve re-ser extraído com clorofórmio.

3. Tecidos com índice alto do ácido nucleico/ribozyme: o baço/thymus tem o índice alto do ácido nucleico e do ribozyme. O tecido de moedura sob as circunstâncias de congelação seguidas pela homogeneização rápida pode eficazmente neutralizar ribozymes. Contudo, se o lysate é demasiado viscoso (devido ao conteúdo em acido nucleico alto), a extração do PCI não poderá estratificar eficazmente; adicionar mais lysate pode resolver esta edição. As extrações múltiplas do PCI podem remover um ADN mais residual. Se um branco precipita formulários imediatamente depois de adicionar o álcool, indica a contaminação do ADN. Re-extração com PCI ácido depois que a dissolução pode remover a contaminação do ADN.

4. Tecido de planta: O tecido de planta é mais complexo do que o tecido animal. Geralmente, as plantas são moídas sob as condições do nitrogênio líquido, assim degradação do RNA por enzimas endógenas são raras. Se o problema da degradação não é resolvido, está causado quase certamente pelas impurezas contidas na amostra. As impurezas contiveram em muitas plantas conduzirão aos resíduos, e a razão para resíduos é frequentemente porque estas impurezas têm algumas similaridades com RNA: você precipita e eu precipito, e você fixa e eu fixo. Estas características determinam que são inibidores de enzima muito fortes.

Presentemente, os reagentes comerciais da extração do RNA podem ser adaptados a quase todos os tecidos animais com ajustes pequenos, mas há poucos reagentes comerciais da extração do RNA que podem ser apropriados para a maioria de tecidos de planta. Felizmente, Foregene pode fornecer jogos especiais da extração do RNA da planta, nós tem o jogo total do isolamento do RNA da planta, sinal de adição total do jogo do isolamento do RNA da planta. O último é projetado especialmente para plantas com índice alto do polisacárido e do polyphenol. Para a extração do RNA, o feedback dos usuários do laboratório é particularmente bom.

12. O efeito da amostra que congela e que thawing a amostra congelada pode ser maior, e precisa de ser cortado antes de ser usada para a extração do RNA. As amostras tendem a derreter (possivelmente parcialmente) durante o corte. As amostras congeladas podem precisar de ser pesado antes da extração do RNA, e thawing ocorrerá definidamente durante este processo. Às vezes, thawing da amostra igualmente ocorre durante o processo de trituração do nitrogênio líquido; ou a amostra congelada é adicionada diretamente ao lysate sem nitrogênio líquido que mói, e thawing ocorrerá definidamente antes da homogeneização completa. As experiências mostraram que o tecido congelado é uma degradação mais inclinada do RNA durante thawing do que o tecido fresco. A razão provável: O processo da gelo-aproximação amigável interrompe estruturas dentro da pilha, facilitando a para que as enzimas endógenas entrem o contato direto com o RNA.

13. O julgamento da qualidade do RNA geralmente, eletroforese é usado para julgar a integridade do RNA, e A260/A280 é usado para julgar a pureza do RNA. Na teoria, o RNA intacto tem uma relação de 28S: 18S = o 2.7:1, e a maioria de dados sublinham a relação de 28S: 18S = 2: 1. O fato é que quase nenhum do RNA extraído das amostras diferentes das pilhas está em uma relação do 2:1 (este foi obtido usando o Agilent Bioanalyzer).

Os resultados da eletroforese do RNA são afetados por muitos fatores, incluindo a estrutura secundária, as condições da eletroforese, a carga da amostra, o grau de saturação pelo EB, etc. Use a eletroforese nativa para detectar o RNA e usar o marcador do ADN como um controle. Se os 28S em 2kb e no 18S em 0.9kb são claros, e 28S: 18S > 1, a integridade pode cumprir as exigências da maioria de experiências subsequentes.

A260/A280 é um indicador que cause muita confusão. Antes de mais nada, é necessário esclarecer o significado original deste indicador para ácidos nucleicos: RNA puro, seu A260/280 = aproximadamente 2,0. O RNA puro é os because e A260/A280 = 2 é o ‘efeito’. Agora todos está usando A260/A280 como um because, pensando aquele “se A260/A280 = 2, a seguir o RNA é puro”, que conduz naturalmente à confusão.

Se você está interessado, você pode adicionar um reagente pequeno que seja usado frequentemente na extração, tal como o fenol, o isothiocyanate do guanidine, o PEG, etc., a sua amostra do RNA, e meça então a relação A260/A280. A realidade é que muitos dos reagentes usados para a extração do RNA, assim como muitas impurezas na amostra, absorvem em torno de A260 e de A280, afetando A260/A280.

A aproximação a mais instrutivo é presentemente fazer a varredura de amostras do RNA na escala de 200-300 nanômetro. A curva do RNA puro tem as seguintes características: a curva é lisa, A230 e A260 são dois pontos da inflexão, A300 são próximos a 0, a A260/A280 = ao redor 2,0, e a A260/A230 = ao redor 2,0. Se os dados da varredura não estão disponíveis, a relação A260/A230 deve igualmente ser determinada, porque esta relação é mais sensível ao transporte de todas as impurezas que afetam a reação enzimático. Tome em consideração a escala linear do dispositivo (0.1-0.5 para A260).

Há outros dois fenômenos úteis: a relação será aproximadamente 0,3 mais baixo quando A260/A280 é medido na água; quando a relação mediu no EDTA de 10 milímetros são aproximadamente 0,2 mais alto do que aquele medido no EDTA de 1 milímetro.