Perguntas frequentes para kit de isolamento de RNA total de animais/células

A seguinte análise dos problemas que você pode encontrar na extração de RNA de tecido/célula animal irá ajudá-lo em seus experimentos.Além disso, para outros problemas experimentais ou técnicos, além de instruções de operação e análise de problemas, temos suporte técnico dedicado para ajudá-lo.Se você tiver alguma necessidade, entre em contato conosco em: 028-83360257 ou E-mali: Tech@foregene.com.

O RNA não é extraído ou os rendimentos de RNA são baixos

Muitas vezes, há uma variedade de fatores que afetam a eficiência da recuperação, como: conteúdo de RNA da amostra de tecido, método de operação, volume de eluição, etc.

1. Banho de gelo ou centrifugação criogênica (4 °C) foi realizada durante a operação.

Recomendação: Operar em temperatura ambiente (15-25°C) durante todo o processo, não fazer banho de gelo e centrifugar em baixas temperaturas.

2. Preservação inadequada da amostra ou tempo excessivo de armazenamento da amostra.

Recomendação: Armazenar as amostras a -80 °C ou congelar em nitrogênio líquido e evitar o uso repetido de congelamento-descongelamento;tente usar tecido fresco ou células cultivadas para extração de RNA.

3. Lise de amostra insuficiente.

Recomendação: Ao homogeneizar o tecido, certifique-se de que o tecido esteja suficientemente homogeneizado e que as células do tecido estejam suficientemente divididas para explicar a liberação de RNA.

4. O eluente não foi adicionado corretamente.

Recomendação: Confirme que o ddH2O livre de RNase é adicionado gota a gota ao meio da membrana da coluna de purificação.

5. O volume correto de etanol absoluto não foi adicionado ao Tampão RL2 ou Tampão RW2.

Recomendação: Siga as instruções, adicione o volume correto de etanol absoluto ao Tampão RL2 e Tampão RW2 e misture bem antes de usar o kit.

6. A dosagem da amostra de tecido não é apropriada.

Recomendação: Use 10-20 mg de tecido ou (1-5) × 106 células por 500 μl de tampão RL1, pois o uso excessivo de tecido pode resultar na redução da extração de RNA.

7. Volume de eluição inadequado ou eluição incompleta.

Recomendação: O volume de eluição da coluna de purificação é de 50-200 μl;se o efeito de eluição não for satisfatório, recomenda-se estender o tempo de colocação à temperatura ambiente após adicionar ddH2O livre de RNase pré-aquecido, por exemplo, por 5-10 min.

8. A coluna de purificação tem resíduo de etanol após a lavagem do Tampão RW2.

Recomendação: Se houver resíduo de etanol após a lavagem do Tampão RW2, centrifugação do tubo vazio por 1 min, o tempo para a operação de centrifugação do tubo vazio pode ser aumentado para 2 min, ou a coluna de purificação pode ser colocada à temperatura ambiente por 5 min para remover adequadamente o resíduo etanol.

O RNA purificado é degradado

A qualidade do RNA purificado está relacionada a fatores como preservação da amostra, contaminação por RNase e manipulação, etc.

1. As amostras de tecido não são mantidas a tempo.

Recomendação: Se as amostras de tecido ou células não forem usadas em tempo hábil após a coleta, criopreservar imediatamente a -80 °C ou nitrogênio líquido.Para extrair RNA, use uma amostra de tecido ou célula recém-colhida sempre que possível.

2. Congelamento-descongelamento repetido de amostras de tecido.

Recomendação: Ao armazenar amostras de tecido, é melhor cortá-las em pedaços pequenos para preservação e remover um dos pedaços ao usá-los para evitar o congelamento e descongelamento repetidos da amostra e a degradação do RNA.

3. Introduzir RNase ou não usar luvas descartáveis, máscaras, etc. durante a operação.

Recomendação: Os experimentos de extração de RNA são melhor realizados em salas de manipulação de RNA separadas e a mesa é limpa antes do experimento.

Use luvas e máscaras descartáveis ​​durante o experimento para minimizar a degradação do RNA causada pela introdução de RNase.

4. Os reagentes são contaminados com RNase durante o uso.

Recomendação: Substitua por um novo Kit Animal Total RNA Isolation para experimentos relacionados.

5. Os tubos de centrífuga, pontas, etc. usados ​​na manipulação de RNA estão contaminados com RNase.

Recomendação: Confirme se os tubos de centrifugação, pontas, pipetas, etc. usados ​​na extração de RNA são todos livres de RNase.

O RNA obtido purificado afeta os experimentos a jusante

RNA purificado pela coluna de purificação, se os íons de sal, o teor de proteína é muito grande afetará o experimento a jusante, tais como: transcrição reversa,Northern Blot et al.

1. O RNA eluído tem resíduos de íons de sal.

Recomendação: Confirmar que o volume correto de etanol foi adicionado ao Tampão RW2 e realizar 2 lavagens da coluna de purificação na velocidade centrífuga indicada para operação;se houver algum resíduo de íon de sal, deixe a coluna de purificação no Tampão RW2 por 5 min à temperatura ambiente e realize a centrifugação para maximizar a remoção da contaminação do sal.

2. Resíduo de etanol em RNA eluído.

Recomendação: Confirme que após a lavagem do tampão RW2, realize a operação de centrifugação do tubo vazio na velocidade de centrifugação indicada para operação, aumente o tempo da operação de centrifugação do tubo vazio para 2 min se ainda houver resíduo de etanol, ou deixe-o em temperatura ambiente por 5 minutos min após a centrifugação do tubo vazio para maximizar a remoção do resíduo de etanol.